维生素D(vitamin D, VD)是人体内一种重要的调节因子, 除参与人体内钙磷代谢, 其在高血压、心血管疾病、肿瘤及糖尿病等疾病中也扮演着重要角色。25 羟基维生素D(25-hydroxy vitamin D, 25(OH)D)是VD在人体内的主要存在形式, 性质稳定(半衰期2 周), 其水平能充分反映食物摄入和自身合成VD 总量, 在精准药物治疗与营养膳食理念方面具有重要意义, 因此, 需要高准确测定25(OH)D 浓度水平。25(OH)D的检测方法,主要包括放射免疫法、酶联免疫吸附法、化学发光免疫测定法、高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。

1、概述

维生素D(vitamin D, VD)是第4 种被鉴定的能有效治疗佝偻病的物质, 被认为是第4种维生素, 因此用字母“D”表示, 为了进一步区分同一类维生素的不同功用, 对该类物质再分配下标, 进而有目前常称的麦角钙化醇(ergocalcilferol, VD2)和胆钙化醇(cholecalcifeol, VD3), 结构式见图1。医学上应用VD 来治疗儿童佝偻病已有90 年的历史, 随着科技的发展, 人们对VD 的认识越来越深入,在过去的20 年有超过50 种的VD 代谢物被报道, 虽然只有少数在血液中进行了量化。25 羟基维生素D(25-hydroxy vitamin D, 25(OH)D)是VD 在血液中的主要运输形式, 性质稳定(半衰期2 周), 其水平能充分反映人体通过食物摄入和自身合成后的VD 的总量, 因此体内VD水平的评价主要通过对25(OH)D 水平的测定。VD 缺乏是世界范围内备受关注的公共卫生问题, 美国第三次全国健康营养检查结果显示近9 成(≥70 岁)的女性存在每日VD 摄入量不足问题, 即存在发生VD 缺乏症风险, 多次VD 营养状况调查显示VD 缺乏在儿童、青少年、妊娠期妇女、老年人更易发生VD缺乏, VD缺乏会激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统, 使人更易患高血压和导致左心室肥大, 所以应有意识督促对这类人群从饮食或制剂中摄入充足VD。

VD 是人体内一种重要的调节因子, 普遍认可其对人体有有益作用, 除了参与人体内钙磷代谢, 近年来的研究发现, 其在高血压、心血管疾病、糖尿病、肿瘤等疾病中也扮演着重要角色, 低水平的VD 浓度会对这些疾病产生负面影响。研究表明, VD 能促进人体对钙和磷的吸收,童年时保证充足的VD 摄入能有效降低老年后患骨质疏松的风险, 因此VD补充剂, 经常与钙一起作为保健品被服用。摄入人体的VD 主要存在2种形式, 即VD2和VD3,有研究表明由于25 羟基维生素D2(25-hydroxyvitamin D2,25(OH)D2)对VD结合蛋白(vitaminD binding protein, DBP)的亲和力低于25(OH)D3的亲和力, 导致25(OH)D2在体内会被更快速清除,即25(OH)D2和25(OH)D3形式对人体内VD 状态的贡献是不同的。为了进一步阐明相关疾病的病理学机制, 流行病学研究中针对血清VD 水平的检测需求出现了惊人的增长, 梅奥医学实验室报告VD 检测量每年增长80%至90%。因VD2 及其代谢产物的血液循环水平远低于VD3及其代谢产物, 有文献报道直接将血清中的25(OH)D3 水平作为衡定VD 营养状态的指标。通过测定25(OH)D2 和25(OH)D3 来评价VD 水平, 在精准药物治疗与营养膳食理念方面具有重要意义。对25(OH)D 的来源、前处理方法和检测方法进行了概述, 对选择合适的25(OH)D 的前处理方法和检测方法提供理论依据。

2、体内VD 的合成及代谢

VD 是人体必需的脂溶性维生素, 可储存在脂肪组织中, 也参与血液循环。血液循环时VD 主要和VD 结合蛋白(DBP)结合。人体VD 主要来源于膳食摄取和皮肤转化。蘑菇和鱼类是较为常见的富含VD 的食物。VD2和VD3 在人体作用机制完全相同, 但来源不同。其中VD2是由植物中的麦角醇,经紫外照射后转变而来,故又名麦角钙化醇, VD3又被称为“阳光维生素”是由暴露在阳光或紫外线的皮下前体分子7-脱氢胆固醇转变而来,又名胆钙化醇。通过皮肤转化或饮食摄取的VD 均具有生物惰性, 要转化成具有生物活性形式还需要经过2 次羟基化。首先摄入的VD 在空肠和回肠被吸收后与乳糜微粒或VD 运输蛋白结合, 经血液系统或淋巴系统运输至肝脏,随后在肝脏中的25- 羟化酶帮助下转化为25(OH)D, 25(OH)D 经血入肾, 被近端小管上皮细胞的线粒体中的细胞色素P450 氧化酶(1α 羟化酶)催化转化成有活性的1,25- 二羟基维生素(1,25-dihydroxy vitamins,1,25-(OH)2D)(又称骨化三醇)[4]。该酶活性会受甲状旁腺激素水平、血钙水平和磷调节。1,25-(OH)2D 可以与各组织中存在的VD 受体(vitamin D receptor, VDR)发生相互作用, 如VD核受体即为控制多重的配体依赖性转录因子,参与细胞增殖, 免疫反应和骨矿化等生物学进程。合成学家在对VD 分子的不同部分进行修饰后, 现已开发出3000 种维生素D类似物, 然而只有极少部分有临床应用。当体内的1,25-(OH)2D 足量时, 会在肾脏24-羟化酶(renal24-hydroxylase, CYP24)作用下进一步转化为24,25-二羟基维生素D[24, 25-dihydroxy vitamin D,24,25-(OH)2D],最后这些代谢物在胆汁中被分解。此外,1,25-(OH)2D 还能通过活化巨噬细胞促使其释放肿瘤坏死因子α, 杀伤或抑制肿瘤细胞。

总而言之, 人体中VD 会以多种形式存在, 其主要代谢物是25(OH)D 和1,25-(OH)2D,并主要通过有活性的1,25-(OH)2D 实现其生理功能, 但由于1,25-(OH)2D 在循环血液中含量低(pg/mL), 仅为25(OH)D3 的千分之一, 且半衰期短(4~7 h), 检测时还易受到多种因素的干扰难以作为临床指标。与之相对的25(OH)D 是VD 在血液中的主要运输形式, 占体内VD 总量的95%, 半衰期长(2 周), 这种相当长的血清半衰期可准确指示一段时间内从紫外线照射和饮食摄入中获得的VD 水平。25(OH)D 性质稳定, 其体内循环水平不受血钙和甲状旁腺激素(parathyroid hormone relatedpeptide, PTH)水平影响, 更能充分反映体内食物摄入和自身合成VD 的总量及VD 的转化能力, 真实反映人体的VD状况, 因此临床上认为通过检测血清中25(OH)D的含量来评估人体的VD 水平更加可信。

3、VD 相关性疾病及限量标准

3.1 VD 相关疾病

传统观点中VD 主要生理功能是维持体内钙、磷浓度的平衡。当体内VD 不足时(<20 ng/mL), VD 与甲状旁腺激素的相互作用下降, 会降低钙在肠内的吸收, 使得人体仅能吸收大约10%~15%的钙和60%的磷, 从而对骨健康产生消极影响, 进而引起佝偻病、软骨病、骨质疏松等常见病的发生。在对手足口病患者、子痫前期患者、白癜风患者、乙型肝炎患者、妊娠期糖尿病患者、肺癌患者、慢性心力衰竭等患者的25(OH)D检测, 发现其含量较正常人均出现明显下降且下降程度与疾病严重程度呈正相关, 因此通过检测25-(OH)D 水平可反映疾病的轻、重程度。也有研究表明补充25-(OH)D可以增强疗效, 因此, 临床上越来越关注VD 水平的监测及补充。

从代谢通路上看, VD 还能通过与蛋白激酶C、促丝裂原活性蛋白激酶、蛋白激酶A、磷脂酰肌醇、Ca2+依赖性电压门控通道或Ca2+非依赖性电压门控通道相互作用介导第二信使旁路的激活、影响细胞内信号转导通路、改变细胞内钙浓度、激活或抑制Bcl-2、c-jun, 最终影响细胞增殖、分化和凋亡。VD 具有多种生物作用, 近年的研究发现VD还是一种神经-内分泌-免疫调节激素, 在自身免疫疾病中发挥重要作用。如: 在白癜风发病机制研究中, VD 可抑制自身抗体对黑素细胞的杀伤作用, 增加体内的黑素细胞活性和酪氨酸水平。在血糖控制中, 其可以增加胰岛素敏感性, 促进胰岛素合成及分泌, 从而调节血糖浓度防治高血压。流行病学分析已证实孕期维生素D 缺乏可增加子痫前期风险,可能是发生子痫前期的病因。25(OH)D3 还可以调控单核细胞、中性粒细胞和气道上皮细胞等合成抗菌多肽和B-防御素等抗维生素多肽, 起抗呼吸道感染作用。有文献指出, 较高的VD 摄取和25(OH)D 水平能降低女性患乳腺癌的风险。Gupta 等对1075 名对照组的研究结果表明, 血浆25(OH)D 的水平与乳腺癌的发生风险呈负相关,这一负相关在产后绝经妇女中更加显著。Ke 等报道九成以上慢性丙型肝炎患者中存在VD 缺乏或不足现象,25(OH)D 水平的降低会促进肝纤维化的发展, 从而导致肝硬化或肝癌。及时补充25(OH)D 能够降低肝脂肪变性的发展和组织学病变的严重程度。吴刚等[28]对81 例HBeAg 阴性慢性乙型肝炎患者血清中的25(OH)D3 的测定结果也证实了患者存在25(OH)D3 缺乏。Querfeld 等证明, 通过人为地补充VD, 作为辅助治疗手段能更好地发挥药物的抗病毒效果。Bertone-Johnson在对81183 名50~79 岁的美国妇女血清中的VD 水平研究发现, 高浓度的VD 可以显著降低患抑郁症的风险。使用患者血清中25(OH)D 水平来作为乳腺癌、抑郁症、心血管疾病等多种疾病预后评估的参考指标具有临床价值。目前在中国仍缺乏有针对性的, 长期的、大样本的分析, 在体内VD 水平研究中, 研究人员还可以在1 年４个季节收集多组血样进行25(OH)D 评估, 验证其是否存在季节差异性。

3.2 限量标准

美国医学科学院推荐25(OH)D 血浓度大于20 ng/mL有利于骨骼健康。也有文献将VD 缺乏定义为血清25(OH)D 低于20 ng/mL, VD 不足为21~29 ng/mL, 充足为30 ng/mL 以上, 而大于150 ng/mL 可能会导致中毒。还有文献直接按体内血清25(OH)D3水平将VD水平标准分为5 类, 严重缺乏(<25nmol/L)、缺乏(<50nmol/L)、不足(52~72nmol/L)、充足(≥75nmol/L), 正常值(上限为100nmol/L)及中毒(>374nmol/L)。

4、25(OH)D 前处理方法

为了使25(OH)D 测定在临床生物化学实验室中得到更广泛的应用, 有必要简化提取程序, 并简化或消除色谱纯化步骤。表1 中列举了几种常见的前处理手段, 其大概的流程是: 先将内标加入血清或血浆中, 然后用有机溶剂沉淀蛋白质, 离心后, 进行固相萃取(solid phase extraction, SPE)程序, 最后将纯化的样品注入液相色谱-串联质谱仪(liquid chromatography-tandem massspectrometry, LC-MS/MS)。目前各种仪器分析方法都涉及复杂的样品制备, 这是由于维生素及其代谢物在循环血液中主要和特异性维生素D 结合蛋白或白蛋白偶联, 仅有0.03%的25(OH)D 以游离形式存在, 其在血浆中的浓度在10~50 ng/mL。所以前处理过程中一般需要使用甲醇等有机溶液使蛋白质发生变性, 将维生素D 从结合蛋白上释放出来,也有文献选择用NaOH 来破坏蛋白与维生素D 的结合。然后通过液-液萃取、固相萃取等方法提取、净化、浓缩样品中的25(OH)D, Knox 等[38]开发了一种6 步的自动化固相萃取机, 常见的样品提取剂有正己烷、10%二氯甲烷-正己烷,其中正己烷萃取被认为是最简单的方法, 因其能够在沉淀蛋白质的同时去除水溶性干扰物。最后萃取物在氮气下干燥后使用复溶液(甲醇水等)复溶, 进样检测。Chen 等开发了一种免疫亲和净化方法, 在去蛋白的上清液中利用缀合小鼠抗1,25-(OH)2D 单克隆抗体的抗体珠浆, 提取目标物后再通过一定的方法将其洗脱, 很好地去除了血清中的基质效应。随着科技的发展, 自动化技术普遍应用于前处理过程, 已有专门的自动化设备投入应用, 包括一种简单的蛋白质沉淀方式, 利用填充有惰性硅藻土材料的过滤板进行自动的SPE 程序。自动化设备不但可以增加处理通量,还可以避免在液-液萃取、固相萃取(SPE)和溶剂蒸发等步骤中由于人为因素带来的误差。

5、25(OH)D 检测方法

目前 25(OH)D 检测方法主要分为免疫法和色谱法。传统的免疫法有: 放射免疫法(radioimmunoassay, RIA)、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 、化学发光免疫测定法(chemiluminescence immunoassay,CLIA)及色谱法-主要包括高效液相色谱法(high performance liquidchromatography, HPLC)和LC-MS/MS。多数文献中检测25(OH)D 所用生物样本为血清, 其他样本还有血浆或干血点等。

5.1 放射免疫法(RIA)

针对25(OH)D 的放射免疫分析最早于1985 年由Hollis 等提出, 其以3H-25(OH)D对样品进行加标, 实验过程中所有标准品和对照物均在血清基质中并与血清样品同步提取, 此时示踪物3H-25(OH)D 与待测样品中25(OH)D 竞争性结合抗25(OH)D 山羊抗体,然后用2 步抗原抗体反应以实现固液分离, 最后通过检测沉淀中3H 的放射量来计算样品中的25(OH)D 的浓度。随着技术的发展,现普遍使用125I-25(OH)D 作为示踪剂, 通过检测沉淀中的125I 放射量来计算25(OH)D 浓度, 该示踪剂极大地提高了该方法的灵敏度。在较早的研究中由于实验室间所用质控标准品不同, 测定方法存在差异, 对同一血清样品中25(OH)D 测定结果往往存在较大的差异。例如, 来自绝经后妇女的42 个样本被送到实验室A, 使用乙腈提取并使用他们自己内部的放射免疫方法。在42 名患者中, 17%被归类为维生素D 不足[血清25(OH)D＜80 nmol/L]。来自同一组女性的20 个不同的标本送去实验室B, 其使用商业上可获得的RIA 法制备的试剂盒检测。该方法测定的血清25(OH)D 值, 90%的女性被分类为维生素D 不足。随着科技的发展, 制备出更合适的抗体, RIA 有了巨大发展。Farrell 等用RIA 法与LC-MS/MS 法对170 例血清样品连续5 d 每个样品各重复测定5 次, 结果评估显示,LC-MS/MS 法一致相关性为0.99, 平均偏差为1.4 nmol/L。由于该测定法在测定之前不需要样品预纯化, 灵敏度高,特异性强, 对仪器设备要求不高, 更适用于基层单位对超微量物质的测定。RIA 测定法被美国食品和药物管理局批准用于临床应用(DiaSorin, Stillwater,MN)。但该方法仍存在一些固有局限,如其不能区分25(OH)D2 和25(OH)D3,只能反映出人体内总的25(OH)D 水平, 且最后放射性物质的处理上对检测人员与环境存在一定风险。

5.2 酶联免疫吸附法(ELISA)

酶联免疫吸附法(ELISA)也是VD 测定时常用的方法,其将25(OH)D 的单克隆抗体结合在固相载体上, 利用抗原抗体的特异性结合进行定性或定量。该方法多用于试剂盒的制备, 英国IDS 公司与中国博晖创新光电技术股份有限公司曾推出针对25(OH)D 的检测试剂盒, IDS 使用生物素标记的25(OH)D, 将其添加到校准品, 对照品和25 μL 未经染色的血清样品中。微孔板先包被羊25(OH)D 抗体,然后将稀释的样品加入到微孔板中孵育, 让样品中的25(OH)D 与固定量的25(OH)D 很好地竞争性结合微孔板上抗体。在洗涤孔后, 用过氧化物酶标记的抗生物素蛋白和四甲基联苯胺作为底物, 完成显色。IDS 酶联免疫试剂盒说明书中声称所使用的羊多克隆抗体对25(OH)D3 结合特异性为100%, 对25(OH)D2 的结合特异性为75%。高玲娟等对IDS 检测维生素D 的试剂盒进行性能验证,结果显示: 试剂盒测定25(OH)D 批内与批间不精密度均≤5%,定值质控品相对标准偏差≤8%, 拟合曲线(三次多项式)分析, R2≥0.99, 最低检出限为5 nmol/L。各项指标均达到美国临床和实验室标准化协会(Clinical and LaboratoryStandards Institute, NCCLS)的文件标准。张天勇等对国产检测血清25(OH)D3 的ELISA 试剂盒进行评价, 批内10次测定的变异系数(coefficient of variation, CV)为9.8%, 批间10 次测定的CV 值为13.2%。每次测定线性相关系数均达到0.999, 最低检测限为10 μg/L。

叶青等采用ELISA 法对824 例0~6 岁儿童血清25(OH)D 进行检测, 结果显示25(OH)D 的平均值(69.52±57.09) nmol/L, 25(OH)D 缺乏(大于25 nmol/L 且小于50 nmol/L)160 例, 占受检人数的19.42%。刘冬妹等用ELISA 法对1246 例0~6 岁儿童血清25(OH)D3 进行检测, 结果显示25(OH)D3的平均值(25.398±7.765) μg/L, 25(OH)D3缺乏(小于20 μg/L)313 例, 占受检人数的25.12%。

李晓云等曾以LC-MS/MS 法为标准对ELISA 法进行了评价, 选取的50 例患者的血清样品用LC-MS/MS 法测定25(OH)D3 水平均数为(14.99±6.51) ng/mL, 用ELISA法测定的均数为(20.91±9.70) ng/mL, 两者的相关性为0.725, 发现LC-MS/MS 测定值整体低于ELISA, 即使用ELISA法进行评价维生素D 水平会低估体内维生素D的缺乏, 可能造成临床决策失误。

5.3 克隆酶供体免疫测定法(CEDIA)

CEDIA 该测定基于β-半乳糖苷酶的α-互补性原理。试剂盒中酶供体(enzymedonor, ED)标记的VD 与样本中的25(OH)D 竞争结合VD 抗体, 结合了VD 抗体的ED 由于空间位阻将不能再与酶受体(enzymeacceptor, EA)结合形成具有活性的β-半乳糖苷酶。反应平衡后, 剩余的未结合VD抗体的ED 标记的VD 与EA 结合形成具有活性的β-半乳糖苷酶, 因此, 表现为样本中的25(OH)D浓度与形成的β-半乳糖苷酶活性成比。β-半乳糖苷酶活性的检测是以2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷作为底物, 反应生成的产物在415 nm 处有最大吸光度, 通过在415 nm 处测定吸光度的变化值, 即评价, 批内2 个质控10 次测定CV值为1.49%和2.11%, 批间2 个质控3 次测定的CV 值为2.84%和0.97%。线性范围9~143 ng/mL 线性相关系数不低于0.99。

5.4 化学发光法(CLIA)

化学发光法(CLIA)首先需要将一定的化学发光示踪剂(连接有异鲁米诺衍生物的25(OH)D)加入样品中, 使其与样品中的25(OH)D 竞争结合涂覆在顺磁珠上的抗血清。待反应结束后加入适量激发剂(鲁米诺和过硼酸钠), 通过检测化学荧光信号来计算样品中的25(OH)D。目前, Ersfeld等开发的一种针对25(OH)D 的CLIA 测定法, 与RIA 比较, 相关系数为0.94; 与LC-MS/MS 比较, 相关系数为0.95, 且该方法已在LIAISON 分析仪上实现完全自动化,单次测定时间40 min, 平均每小时能分析90 个样品。但由于该抗血清对25(OH)D2 和25(OH)D3 具有同等效应, 因此通过该方法测定的仍为总的25(OH)D 水平。以CLIA 为基础的试剂盒开发上, 宋翠翠等制备的针对25(OH)D 化学发光检测试剂盒最低检出限4.9ng/mL, 准确度相对偏差小于10%, 批内变异系数为6.5%, 批间变异系数为8.9%。牟夏莲用化学发光法对477 例7~13 岁小学生血清25(OH)D 进行检测, 结果显示25(OH)D 的平均值(16.93±6.45) ng/mL, 25(OH)D 缺乏(＜20 ng/mL)324 例, 占受检人数的67.92%。

在化学发光的基础上发展的电化学发光技术也被应用于25(OH)D 的检测。刘肖英用电化学发光免疫分析法(ECLIA)对2877 例0~6 岁婴幼儿血清25(OH)D 进行检测, 结果显示25(OH)D 的平均值(82.43±14.26) nmol/L。25(OH)D缺乏(大于25 nmol/L 且小于50 nmol/L)144 例, 约占千分之一。周东芳等用罗氏电化学发光法对3371 例孕妇女血清25(OH)D 进行检测, 3371 例孕妇女25(OH)D 测定平均值为(13.64.±6.484) ng/mL, 25(OH)D 缺乏(＜20 ng/mL)2836 例,占受检人数的84.13%。可能与孕妇户外活动减少、缺乏紫外线暴露有关。

整体而言, 免疫法均较容易受温度、基质、抗体状态等因素影响, 批内及批间变异系数(coefficient of variation, CV) 、精密度存在较大的偏差且设计的特异性结合25(OH)D 的抗体和VD 的其他代谢物之间存在交叉反应。即维生素羟化物都能与抗体存在不同程度反应, 通过该方法只能测定得25(OH)D 的总量, 不能满足同时测定25(OH)D2 和25(OH)D3 的需求。但该方法对设备及操作人员的要求相对简单, 在开发针对25(OH)D 的试剂盒具有重要意义。更适合自动化仪器的应用, 在大规模筛选及检测VD 上具有不可比拟的优势。

5.5 高效液相色谱法(HPLC)

高效液相色谱法(HPLC)是一种传统的色谱法, 主要通过液相中的色谱柱实现将目标物分离, 然后再电化学检测器或紫外检测器中检测。1977 年第一次报道了25(OH)D的紫外检测试验, 该方法实现了25(OH)D2 和25(OH)D3 的分离。其灵敏度、特异性、准确性良好, 可在单次测定中准确定量多种分析物。

阳利龙等用HPLC 法测定血清中25(OH)D3, 结果表明该方法拥有良好的精度,在6.7~335.5 nmol/L 浓度范围内线性良好(r=0.9971), 方法回收率在90%~110%之间,萃取回收率大于70%, 日内日间相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)小于6%。叶怀庄等用HPLC 对2028 名6~11 岁的小学生中筛检出晚发性佝偻病可疑者221人的血浆25(OH)D3 进行检测, 血浆25(OH)D3 在20~320 ng/ml 的浓度范围内线性关系良好(R2=0.9992), 方法的回收率为96.34%, 相对标准偏差为4.58%, 最小检出浓度为0.06 ng/mL(S/N=3)。确诊晚发性佝偻病患者151 人中血浆25(OH)D3<10 ng/mL有146 例, 占受检人数的96.7%。陈道平等用HPLC 对30 名肺癌患者和30 名健康人血清25(OH)D 进行检测, 患者血清的25(OH)D 水平是(23.4±7.9) ng/mL 显著低于健康组的(36.2±7.6) ng/mL。

HPLC 能实现25(OH)D2 与25(OH)D3 的分离, 但由于25(OH)D2 在血清中的浓度远低于25(OH)D3 的浓度, HPLC对25(OH)D2 的检测限不能达到临床要求, 且该方法所需的样品量大, 难以满足临床上的要求, 又因前处理复杂且涉及多种有毒有害的有机试剂,所以目前在临床上的使用较少, 有逐步被LC-MS/MS 取代的可能。

5.6 液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)

液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)具有非常高的灵敏度、特异性和准确性。同位素稀释LC-MS/MS 更是国际上公认的检测“金标准”。能很好满足同时检测25(OH)D2与25(OH)D3 需求。应用该方法在检测25(OH)D 存在的挑战主要是, VD在不同离子源下的离子化效果不同, 在合适的离子源选择上, 由于25(OH)D 具有天然的亲脂性, 25(OH)D 缺乏易带电的基团, 难以通过常压化学电离源(advanced configuration and powerinterface, APCI)或电喷雾离子源(electron sprayionization, ESI)电离。为提高其离子化效率,研究者往往选择使用衍生化试剂对其进行衍生化, 使其加上一个富含N 原子的基团。在用衍生化试剂对其进行衍生化时, 优先选择将分析物的分子量转移至较高质量范围,从而降低背景噪声的干扰。最初使用的Cookson 试剂, 形成的Disels-Alder 加合物上含有质子亲和原子(氧和氮), 该基团帮助下能够让衍生化产物在正离子ESI 下很容易形成加氢峰[M+H]+, 从而提高对25(OH)D2 和25(OH)D3 的响应值。有文献报道使用MEQTAD 作为衍生化试剂可比完整形式提高15 倍灵敏度。然而复杂的衍生化程序,极大限制了检测通量, 难以满足临床实验室对检测通量的需求。后续研究者普遍避免进行衍生化处理, 有研究提出了通过在流动相中添加甲胺, 使其形成甲胺加合离子[M+CH3NH3]+的方式来提高离子化效率。现使用ESI 时仍一般通过在流动相中添加0.1%甲酸或5 mmol/L 甲胺, 让分析物形成[M+H]+或[M+CH3NH3]+,以获得一个可接受的灵敏度。而在APCI 或者APPI 一般不添加任何电解质。

质谱法中由于同分异构体与目标物拥有一样的质荷比,质谱仪无法区分, 在计算时将同分异构体含量算入目标物中, 使得测量结果偏大。有文献报道25(OH)D3 的差向异构体在新生儿的血浆的浓度中有显著贡献。此外一些内源性成分如: 1α-羟基维生素D3、7α-羟基-4-胆甾烯-3-酮, 也会对血清中25(OH)D 的准确测定产生影响, 所以必须选择合适的洗脱溶液, 设定合适的洗脱梯度以实现良好的色谱分离, 确保内源性干扰物和分析物被分开。这样才能建立一个高灵敏度的人血清中的25(OH)D2 和25(OH)D3 的色谱分析方法。

Tai 等应用同位素稀释的LC-MS/MS, 用APCI 离子源在多反应检测扫描模式下, 25(OH)D3 及其内标物质荷比选择(m/z 401/383, m/z 404/386),25(OH)D2 及其内标物质荷比选择(m/z 413/395, m/z416/398)作为定量离子对进行检测, 离子比为1.4(383.2/401.3)作为阳性鉴定25(OH)D3的附加标准。该测定方法中, 25(OH)D2和25(OH)D3 的加样回收率达到99.0%与101.0%, 绝对回收率达到97.0%和92%。以信噪比为3 时作为最低检测限约为0.15 ng/g, 该方法还具有极高精密度, 当25(OH)D ＞ 1 ng/g 时CV 值为0.2%~0.6%; 当25(OH)D＜1 ng/g 时的CV 值＜2%。曾义8.23%。最低检测限为2 ng/mL。曾贞等[61]用LC-MS/MS 对5017 例0~6 岁儿童血清25(OH)D进行检测, 结果显示25(OH)D 的平均值69.07 nmol/L。25(OH)D 缺乏(大于25 nmol/L且小于50 nmol/L)939 例, 占受检人数的18.71%, 测定VD 相关化合物的LC-MS/MS 方法汇总见表1。

在提高该方法的检测限与灵敏度上, 有学者对设备接口、联用方式等进行优化, 如: Petruzziello 等对ESI-M接口等进行改造后实现超临界流体色谱与质谱联用, 该方法能一次性测定包括25(OH)D2 和25(OH)D3 在内的14 种脂溶性维生素和类胡萝卜素。Kushnir 等使用二维色谱分离再通过液相色谱-串联质谱分析样品。

总而言之, LC-MS/MS 检测方法满足同时测定25(OH)D2 和25(OH)D3 在临床上的要求, 被认为是现阶段最准确的检测方法, 结果真实可信, 因此常作为其他检测方法的参考标准。但从目前来看, LC-MS/MS 仍需要一个耗时且复杂的前处理过程, 许多手动样品制备程度限制了该方法的通量, 复杂的设备操作对操作人员有更高的要求,昂贵的设备也使其在临床推广上存在一定局限。

VD 对人体健康至关重要, 体内25(OH)D 水平在多种在多种疾病的诊断上具有借鉴作用, 但目前缺乏规模大、范围广、时间跨度长的实验数据的支撑, 无法量化相关疾病与25(OH)D 水平具体相关性。VD 营养状况调查显示, 在儿童、青少年、妊娠期妇女、老年人等人群中普遍存在VD 缺乏问题, 需要在日常饮食加大蘑菇和鱼摄入,以保证充足的VD 的摄入。充足的VD 水平在包括抑制自身免疫疾病、调节免疫功能、支持心血管系统功能、维持对皮肤的抗恶性细胞增殖作用及抑制癌症进展中具有积极作用。RIA、ELISA、CLIA 以及HPL 和LC-MS/MS 均能实现25(OH)D 水平的测定。

RIA、ELISA、CLIA 法使用的特异性结合25(OH)D 的抗体较易受温度、基质、抗体状态等因素影响, 批内及批间CV、精密度存在较大的偏差且特异性结合25(OH)D 的抗体与其他的维生素羟化物存在不同程度反应, 通过该方法只能测定得25(OH)D 的总量, 不能满足同时测定25(OH)D2 和25(OH)D3 的需求。HPLC 对25(OH)D2 的检测限不能达到临床要求, 且该方法所需的样品量大, 难以适用于临床检测。同位素稀释LC-MS/MS法能准确地测定血清中维生素25(OH)D2 和25(OH)D3, 是公认的25(OH)D 的检测的“金标准”, 通过该方法测定的指标有希望成为临床上的一个重要指标, 用于评估心血管疾病、高血压、肿瘤糖尿病等疾病风险, 尤其在疾病的前期诊断和预防上有重要意义。该类技术将不断成熟, 量化血清、奶粉、米糠等基质中25(OH)D 含量, 为不同人群指导补充VD 提供科学依据。最后借助分析技术对人不同阶段的25(OH)D 含量进行跟踪测定, 将维生素营养代谢研究推向更深的层次。

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